【冬氨酸□活性部位氨基酸残基的研究】王志武.pdf

青大学硕一学位论文目录提要前言材料和方法一、材料二、方法(一)、天冬氨酸酶基因的定点突变 1、菌体培养 2、质粒的提取 3、制备性电泳 4、PCR反应.1S 5、除去脱氧尿嘧啶 6、连接7、感受态细胞的制备及转化 8、筛选(二)、基因定点突变的检测 1、菌体培养 2、质粒的提取 3、酶切检查 4、模板的制备 5、PCR反应 6、琼脂糖凝胶电泳(三)、酶的分离提纯 1、菌体培养及破碎 2、除核酸.3、50 (NH)2SO4沉淀 4、热变性

吉林大学硕士学位论文提要采用一种改进的PCR技术.直接在含有天冬氨酸酶基因的质粒上进行定点突变.将天冬氨酸酶的Lys-139突变为Arg-139和 Leu-139．得突变酶K139R和K139L。天冬氨酸酶突变基因能正常表达.经PCR点突变检测法和内切酶法进行突变酶检测.突变体按预定突变:所表达的天冬氨酸酶突变体均无天冬氨酸酶活性.经光谱学分析,突变体蛋白质的构象无可觉察变化。

吉林大学硕士学位论文是个厌氧型的酶24。天冬氨酸酶基因转化到C.glutamicum菌中可提高赖氨酸的产量(23],还可以用于生产丙氨酸[26]。此外,还得到酶活力提高约30倍的E.coliK-12和39倍的S.marcescens突变株,但重组质粒均不稳定。近年来、Nishimura等人成功地获得了酶活力提高约80倍的菌株AT202、通过引l人par基因片断大大地提高重组质粒的稳定性[271.1.酶的活性部位大肠杆菌天冬氨酸酶的单晶已获得,单晶呈空间组P222对称,a=156A,b=147A,C=102A,分辨率达2A128)E.