【大麦黄花叶病毒中国株系RNA15末端NIaNIb和CP基因的克隆及CP基因的序列测定】.pdf
4 4 46 1> 1> 889目录 一.总RNA浓度的测定和甲酰胺变性凝胶电泳 一.总RNA的提取和测定 2.LiC1沉淀法提取总RNA 3.总RNA的甲酰胺变性凝胶电泳 cDNA的合成与PCR扩增 3.PCR产物的检测和纯化 三.重组质粒的构建 1.载体质粒的连接前处理 2.基因片段的连接前处理.四.重组质粒的转化和筛选 1.感受态细胞的制备 五.重组质粒的大量提取和纯化 1.碱法大量提取重组质粒 2.聚乙二醇沉淀法纯化质粒 六.序列测定及分析 摘要 前言.材料与方法 1.材料来源.
摘要 本文通过常规的基因克隆技术,采用RT-PCR方法将大 麦黄花叶病毒中国株系(BaYMV-C)RNA1上四段共约4k 的基因片段进行了克隆,初步筛选到了CP基因的重组质粒,并对其进行了测序比较研究。同时对基因克隆操作中的有关 本实验首先采用LiCI沉淀法从有明显感染了BaYMV病 状的大麦叶片中提取出了总RNA,经过甲酰胺变性凝胶电 泳检测和紫外分光光度计浓度测定之后,用AMV-RT反转录 酶反转录为cDNA,其中包括了BaYMVRNA1和RNA2的 cDNA。
BaMMV的RNA2均产生98kD的多聚蛋白,经蛋白酶水解后产生28kD 的P和70kD的P2。P只具有蛋白酶活性结构域(而与Potyviruses 相对应的Hc-Pro还具有与蚜虫传播有关的结构域)6.P2可能与病毒 BaYMV和BaMMV在不同的地区和不同的时期里均存在广泛的株 系分化,根据其致病性、血清学关系、生化特性等可作出初步的划分,核苷酸序列的测定和比较是株系分化最可靠的研究方法,也是许多植物 病毒基因克隆测序的一个目的之一”。另外还有一些敏捷快速研究株系 Assay,RPA)30、限制性片段长度多态(RFLP)31]、单克隆抗体[等。