【水稻培养细胞玻璃化法超低温保存的机理分析及应用研究】.pdf

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水稻培养细胞玻璃化法超低温保存 的机理分析及应用研究 目录 一、水稻胚性悬浮细胞系的建立 二、细胞的玻璃化法超低温保存 三、细胞的两步法超低温保存 一、水稻胚性悬浮细胞系的建立及特性研究 1.胚性愈伤组织的诱导 2.胚性悬浮细胞系的建立 3.胚性悬浮细胞系的特性研究 二、水稻胚性悬浮细胞系的两步法超低温保存 三、水稻胚性悬浮细胞的玻璃化法超低温保存和植株再生 四、水稻胚性悬浮细胞玻璃化冻存的机理分析 1.玻璃化冻存过程中细胞的存活力 2)FDA-DAPI双染色荧光法检测 2.玻璃化冻存过程中细胞含水量的变化 3.玻璃化过程中生物光子检测 4.前言 禾谷类作物的胚性悬浮细胞系是全能性原生质体的主要来源91,是从事 遗传操作、进行品质改良的良好实验材料、然而胚性悬浮细胞系的建立不仅需花 费大量时间和精力,而且在离体培养的长期继代过程中,还会发生遗传特性的改 变,导致细胞全能性和植株再生能力下降.因此,寻求一种能长期稳定保存 利用液氮(196C)进行超低温保存,是进行植物组织和细胞长期保存的 有效方法。许多组织培养物在液氮超低温保存后能保持很高的存活率,并能再生 出新植株,保持原来的遗传稳定性。水稻胚性悬浮细胞在AA-2+60g/L蔗糖的培养液中培养3天,然后在AA- 2+0m01/L山梨醇培养基中培养1天。上述培养条件均为25C,暗培养.1)过渡:经预培养的水稻胚性悬浮细胞,接每ml细胞(PCV)加人6m1四分 之一浓度保护剂的比例,用四分之一浓度的PVS2-AA在22C过渡处理10分 钟。PVS2配方参见Sakai等,在AA-2培养基中另加30 甘油,15 乙二 醇,15 二甲亚矾和0m01/L蔗糖,作为冻存水稻悬浮细胞的玻璃化保护 2)脱水:将过渡液吸干,悬浮细胞在100 的PVS2-AA中冰浴(0C)处理7 分钟,然后以每个冷冻管细胞和保护剂总体积为0.