【枯草杆菌蛋白□E基因多位点定点突变库的构建及其表型筛选的探讨】.pdf

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应便可形成含有确定突变位点的共价闭环噬菌体基因组。这一设想连同 Gonlian.M.在1986年的五作 o)(E.coliDNApolymera8e催化单链DNA复制的起始)以及DNA化学合成的创举使寡核苷酸的合成得以常规化这一事实共同奠定了赛核苷酸介导的体外定点突变的基础。其基本原理可概述为:含有突变位点的化学合成的塞核苷酸与单链环状DINA褪火并作为DINA多聚酶合成的起始引物,合成完全后在T4DNA连接酶的作用下连接成闭环,再经转化、筛选,最后得到确定点突变的突变子。

突变效率一般只有0-30 ,很不稳定,且大都在10 以下。原因大致有:体外合成不完全。这可能是由于引物与模板褪火不完全或DNA多聚酶活力不高或污染造成,DNA模板中的二级结构、dNTP的纯度不够等因素也会影响体外合成效率,体外合成不完全造成转化后突变子容易丢失。模板不纯,抽提的模板含有内源性小片段。这些小片段引导的合成不造成突变。大多数E.co1i.宿主菌体内存在依赖甲基化的错配修复系统[24]。体外合成好的闭环双链DNA 或未完全合成好的DNA分子进入宿主后,宿主的这一修复系统会根据甲基化的+“链模板修复体外合成的-链中的错配碱基,导致已引入的突变重新消失。